生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。 第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并 行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进， 21世纪初，以Roche454技术、illumina公司的GenomeAnalyzer技术和ABI 公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、HiseqX等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。

 

       近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的 平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得 的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少(低于50ng)，按照目前现有的文库定量及测序方法，准确检测的难度非常大。

 

      测序文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分关键。因为：

 

      1.如果测序文库拷贝数偏低，将不能获得足够的测序数据，导致降低数据产出;

 

      2.如果测序文库拷贝数过高，将产生低质量的测序数据，甚至会导致测序失败。

 

      因此，要控制NGS测序仪上测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行定量分析。

 

      小艾为您推荐GeneCopeia 萌新产品Illumina 平台测序文库定量试剂盒--NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina^® 。这是一种基于 qPCR 方法对 Illumina 平台测序文库进行 DNA 分子数绝对定量分析的试剂盒。它可以对两端含有 Illumina P5、P7 芯片序列的各种类型 DNA 片段文库进行高特异性的快速定量，检测结果灵敏度高，准确度高，重复性好，适用于大多数qPCR仪器。

 

       Illumina 平台测序文库定量试剂盒优势：

 

      灵敏度高—能检出低至 0.0002 pM 的文库样品；

      特异性强—使用抗体修饰法热启动 DNA 聚合酶，避免了 PCR 扩增前的非特异性结合；文库定量引物采用特殊算法设计，不会形成引物二聚体；

      扩增范围广—能检测平均片段长度 1 kb 以内的文库；

      扩增效率高（E>0.92），实验重复性好（R²>0.99）。

   

       Illumina 平台测序文库定量试剂盒包含以下四种成分：

 

      文库DNA定量标准品（qPCR DNA standard for Illumina）：经过梯度稀释的六份十倍比梯度稀释的双链DNA片段溶液（20 pM-0.0002 pM），经过绝对定量和严格质控，用于标准曲线制作；

      文库定量引物（qPCR primer Mix for Illumina）：含有 Illumina P5，P7 芯片序列并经过优化设计的一对qPCR引物；

      2×qPCR预混液（2× BlazeTaq™ NGS qPCR Mix）：含有性能优化的抗体修饰法DNA聚合酶、qPCR反应缓冲液和SYBR Green染料等qPCR反应所需成分；

      ROX参比染料（ROX Reference Dye）。

 

Illumina 平台测序文库定量试剂盒性能数据展示

    图1. DNA标准品扩增曲线与熔解曲线。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina^®检测6个10倍梯度稀释的文库DNA定量标准品，每个标准品平行重复2次。结果显示，试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特性。

 

     图2. 扩增产物电泳图。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina^®扩增文库DNA标准品得到的qPCR产物，电泳分析无非特异扩增现象。

 

 

      图3.两款试剂盒中标准品的对比。将GeneCopoeia的NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina^®和KAPA Library Quantification Kits for Illumina platforms的标准品用BlazeTaq NGS qMix在ABI ViiA 7进行扩增。 两套标准品拟合出的标准曲线基本重合，对应浓度的标准品的△Ct＜0.3。

 

 

     图4：文库扩增效率: 对不同类型的10种illumina文库使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina^®分别检测，每个文库样本进行6个梯度的10倍稀释，计算出的扩增效率如上图显示，10个文库的扩增效率均在90%-110%的范围内，与扩增DNA标准品的效率相近。

 

 

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